作者：张媛媛,程慧,孙艳,王金娥,吴正岩,裴仁军 单位：中国化学会;中国科学院长春应用化学研究所 出版：《》 页数：6页  （PDF与DOC格式可能不同） PDF编号：PDFFXHX2017020020 DOC编号：DOCFXHX2017020029 下载格式：PDF + Word/doc 文字可复制、可编辑
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    • 硫胺素焦磷酸(Thiamine pyrophosphate，TPP)是维生素B1在细胞内的主要活性形式，也是糖、脂肪酸和氨基酸氧化代谢中重要的辅助因子。在细胞内，利用TPP适配体与天然核酶组装成的人工核酶开关调节靶基因表达，目前仅局限于原核、真菌或植物细胞。本实验将原核生物中筛选的“Switch-on”与“Switchoff”的两种类型的TPP核酶开关，运用重叠延伸PCR的方法构建于增强绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的3'非翻译区(UTR)，转染人胚肾上皮细胞(HEK293)，通过荧光显微镜和流式细胞仪分析，观察了不同浓度TPP对EGFP表达能力的调控。结果表明，构建的两种“Switch-on”和一种“Switch-off”核酶开关均表现出明显的TPP浓度依赖性，且具有良好的特异性，在150μmol/L TPP时分别将EGFP的荧光强度提高3.1倍、1.9倍和降低2.3倍。这种构建通过TPP与核酶开关中其适配体的特异性作用直接将TPP浓度的变化转化为报告基因表达的改变，利于通过荧光检测方法实现对哺乳活细胞内代谢物或因子的无标记、无损伤、可视、高效的检测。

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